韓國(guó)國(guó)家癌癥中心：納米凝膠增強(qiáng)腫瘤成像和光動(dòng)力治療效果
發(fā)布時(shí)間：2021-11-08 11:53:36 人氣：1956
研究背景
光動(dòng)力療法(PDT)已經(jīng)被成功的應(yīng)用于癌癥的治療，光動(dòng)力治療需要光照、氧氣以及光敏感的藥物(如光敏劑)來(lái)殺死癌癥細(xì)胞。但是，由于光敏劑(PS)的疏水性、腫瘤特異性差以及在正常組織中不必要的光毒性作用，限制了PDT的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)PS-復(fù)合納米顆粒能夠提高PS的水溶性，延長(zhǎng)PS在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，從而增加PS分子在腫瘤的聚積。而聚合物材料往往被作為光敏劑輸送的材料。
Fucoidan‑Based Theranostic Nanogel for Enhancing Imaging and Photodynamic Therapy of CancerMi Hyeon Cho, Yan Li, Pui‑Chi Lo, Hyeri Lee, Yongdoo Choi*Nano-Micro Lett.(2020)12:47https://doi.org/10.1007/s40820-020-0384-8
本文亮點(diǎn)
1一種基于巖藻多糖的治療性納米凝膠，由巖藻多糖主鏈、氧化還原響應(yīng)的連接鍵和光敏劑組成，能夠激活腫瘤部位的熒光成像，并增強(qiáng)光動(dòng)力治療的療效，最終誘導(dǎo)癌癥完全死亡。2在納米凝膠平臺(tái)上使用巖藻糖膠作為聚合骨架，可以通過(guò)P-選擇素結(jié)合實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性，并通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的結(jié)合增強(qiáng)抗腫瘤作用。
內(nèi)容簡(jiǎn)介
本文開(kāi)發(fā)了一種基于巖藻多糖的治療納米凝膠(CFN-gel)，該凝膠由具有一定抗腫瘤作用的巖藻糖膠主鏈、氧化還原響應(yīng)性的連接鍵和光敏劑Ce6組成，以實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的可激活近紅外(NIR)熒光成像和增強(qiáng)的光動(dòng)力療法(PDT)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞完全死亡。CFN-gel通過(guò)P-選擇素靶向和EPR效應(yīng)，具有抗血管生成和促進(jìn)腫瘤部位積聚的作用。此外，CFN-gel在全身給藥時(shí)無(wú)熒光和光毒性。細(xì)胞內(nèi)化后，CFN‑gel的光活性隨著細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位的變化而恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的選擇性近紅外熒光成像和增強(qiáng)的PDT治療。本表明，巖藻糖膠納米凝膠是一種高效、特異的腫瘤影像學(xué)和治療新材料。
圖文導(dǎo)讀
I CFN‑Gel的表征
首先，用鹽酸胱胺對(duì)巖藻多糖主鏈的羧酸進(jìn)行修飾；然后將Ce6結(jié)合成氨基端的巖藻聚糖上來(lái)制備CFN-gel。根據(jù)1H-NMR計(jì)算出，每個(gè)巖藻多糖主鏈上結(jié)合20.3 Ce6光敏劑分子。將Ce6-巖藻聚糖結(jié)合物凍干并在水溶液中重新分散后可以自組裝為納米凝膠，其水合粒徑和zeta電位分別為259±59 nm和-22.2 mV。TEM圖像證實(shí)了納米凝膠的形成。CFN-gel有明顯的聚集導(dǎo)致熒光淬滅的現(xiàn)象。與含表面活性劑溶液中的CFN-gel相比，PBS溶液中的CFN-gel的熒光強(qiáng)度淬滅了10倍。
圖1 (a)Ce6-巖藻糖膠納米凝膠(CFN-gel)的合成步驟；(b)CFN-gel及其作用方式示意圖。
圖2 CFN-gel(a)水合粒徑的分布；(b)TEM圖像。CFN-gel在含表面活性劑和PBS溶液中在2 μM Ce6當(dāng)量下的紫外/可見(jiàn)吸收光譜(c)；熒光發(fā)射光譜(d)。
II NIR熒光和SOG的氧化還原響應(yīng)
在細(xì)胞內(nèi)，CFN-gel中的二硫鍵通過(guò)氧化還原反應(yīng)裂解釋放Ce6分子，從而誘導(dǎo)熒光發(fā)射和SOG的生成。當(dāng)用5 mM DTT處理CFN-gel時(shí)，其熒光強(qiáng)度較未用DTT或低濃度DTT處理的凝膠提高了4.9倍，說(shuō)明二硫鍵斷裂后，CFN-凝膠中聚集的Ce6分子可以有效釋放，從而開(kāi)啟CFN-gel的熒光。采用singlet oxygen sensor green(SOSG)作為單重態(tài)氧檢測(cè)試劑，對(duì)CFN-gel在670 nm光照下的SOG進(jìn)行分析。5 mM DTT處理后，CFN-gel SOG的生成量較0或5 μM DTT處理的CFN-gel提高了1.9倍。這些數(shù)據(jù)表明，CFN-gel具有氧化還原響應(yīng)熒光發(fā)射和光毒性。
圖3 熒光信號(hào)的氧化還原響應(yīng)開(kāi)啟和CFN-gel的單線態(tài)氧生成。(a)DTT處理CFN-gel 4 h后的熒光發(fā)射光譜；(b)670 nm激光照射下DTT處理的CFN-gel，SOSG熒光隨時(shí)間的增加(n=4)。
III CFN-gel的SPR分析
通過(guò)SPR分析比較CFN-凝膠與VEGF-165和P-選擇素的結(jié)合特性。VEGF-165與巖藻多糖和CFN-gel的平衡解離速率常數(shù)(KD)分別為953.0和756.1 nM。P-選擇素與巖藻聚糖和CFN-gel的KD值分別為69.71和718.9 nM。
圖4 表面等離子體共振(SPR)分析。
IV 體外細(xì)胞研究
CFN-gel在含血清蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中具有良好的分散穩(wěn)定性。HT1080腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)顯示，CFN-gel被有效地內(nèi)化到腫瘤細(xì)胞中，熒光淬滅的Ce6在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)氧化還原響應(yīng)釋放后，熒光被激活。CFN-gel的細(xì)胞攝取量至少是游離Ce6的18倍。采用CCK-8法比較細(xì)胞存活率，探討CFN-gel對(duì)HT1080癌細(xì)胞的體外治療作用。在沒(méi)有光照的情況下，試驗(yàn)濃度下，游離Ce6處理6h的癌細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性。同樣，在0.1至2.5 μM的濃度下，觀察到CFN-gel處理的癌細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性。隨著CFN-gel濃度從5 μM、10 μM和20 μM增加，細(xì)胞活力逐漸下降，分別為88.3%、85.9%和60.2%。CFN-gel處理24小時(shí)進(jìn)一步降低了細(xì)胞活性，而游離Ce6在高達(dá)10 μM的濃度下處理24小時(shí)，腫瘤細(xì)胞未顯示任何細(xì)胞毒性作用。用CFN-凝膠或游離Ce6在不同濃度下孵育HT1080細(xì)胞6h，用670 nm，10 J/cm2的激光照射(劑量率50 mW/cm2)后，繼續(xù)孵育24h，結(jié)合Ce6的CFN-gel的IC50值約為2.73 μM。相比之下，游離Ce6處理的細(xì)胞在光照下沒(méi)有治療作用。
圖5 游離Ce6和CFN-gel處理HT1080癌細(xì)胞的近紅外熒光圖像(a)；熒光強(qiáng)度的定量分析(b)；不同濃度的游離Ce6和CFN-gel對(duì)HT1080細(xì)胞的體外暗毒性(c)；在670 nm光照(50 mW/cm2, 10 J/cm2)下的體外光毒性(d)。
V 體內(nèi)近紅外熒光成像
使用異種移植小鼠腫瘤模型來(lái)評(píng)估CFN-gel在體內(nèi)腫瘤成像中的應(yīng)用。靜脈注射后5分鐘和24小時(shí)獲得近紅外熒光圖像(λex=660/20 nm，λem=710/40 nm)。注射后5 min，游離Ce6處理的小鼠全身呈現(xiàn)高熒光強(qiáng)度，而CFN-gel處理的小鼠則呈現(xiàn)低熒光信號(hào)。注射后24小時(shí)，在游離Ce6處理的小鼠體內(nèi)觀察到少量熒光信號(hào)，說(shuō)明大部分Ce6從體內(nèi)清除，而在腫瘤組織中也沒(méi)有明顯的游離Ce6積聚。相反，注射后24小時(shí)，CFN-gel處理的小鼠仍能在全身觀察到熒光信號(hào)，并且腫瘤部位與周圍正常組織有明顯區(qū)別。表明了注射的CFN-gel不僅延長(zhǎng)了腫瘤組織的血液循環(huán)和腫瘤蓄積，而且還使熒光激活，與體外研究結(jié)果一致。收集小鼠的主要器官，可以發(fā)現(xiàn)CFN‑gel處理的小鼠，其腫瘤部位有很強(qiáng)的熒光。根據(jù)HT1080腫瘤切片CD62P染色，還觀察到高P-選擇素表達(dá)，說(shuō)明除EPR效應(yīng)外，P-選擇素在腫瘤組織中的高表達(dá)增強(qiáng)了CFN-gel的腫瘤靶向性。
圖6 選擇性腫瘤成像在異種移植瘤模型中的體內(nèi)評(píng)價(jià)。
VI CFN‑Gel的抗腫瘤作用
通過(guò)測(cè)定HT1080異種移植瘤模型的腫瘤生長(zhǎng)率，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了CFN-gel聯(lián)合PDT的抗腫瘤作用。CFN-gel+PDT組與PBS組、游離Ce6+PDT組和CFN-gel組相比，體內(nèi)治療效果明顯增強(qiáng)。TUNEL實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CFN-gel和光照的顯著治療效果。可能由于CFN-gel被內(nèi)化到P-選擇素過(guò)度表達(dá)的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中并在光照下破壞它們，導(dǎo)致第4組腫瘤切片的CD31染色幾乎看不到血管生成性腫瘤血管。
與PBS對(duì)照組相比，單獨(dú)使用CFN凝膠的小鼠在第7-10天顯示腫瘤生長(zhǎng)延遲，這可能是由于巖藻聚糖本身的抗癌潛力所致。免疫組化染色圖像的定量分析顯示，與PBS組相比，CFN-gel治療組的腫瘤中CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量減少了45.3%(***P<0.001)，說(shuō)明CFN-gel具有抗血管生成作用。與PBS組相比，CFN-gel治療組的腫瘤中凋亡細(xì)胞增加了4.9倍(**P<0.01)，這表明CFN-gel在腫瘤中的累積誘導(dǎo)了抗腫瘤作用。
圖7 CFN-gel聯(lián)合PDT體內(nèi)抗腫瘤活性研究。
VII CFN-gel的體內(nèi)生物相容性
組織切片H&E染色，主要臟器未見(jiàn)組織病理學(xué)異常，小鼠的體重?zé)o明顯減輕，說(shuō)明CFN-gel具有良好的生物相容性。
圖8 CFN-gel的體內(nèi)生物相容性。(a)第10天從不同治療組收集的主要器官的代表性H&E染色圖像；(b) PBS、游離Ce6和CFN-gel治療組小鼠第10天的血液化學(xué)數(shù)據(jù)(n=4)；(c)不同組小鼠平均體重隨時(shí)間的變化。在任何治療組中，均未觀察到明顯的器官、血液生物標(biāo)記物和體重毒性跡象。
撰稿：《納微快報(bào)》編輯部
編輯：《納微快報(bào)》編輯部
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